O grao de pureza proteica necesaria depende do uso final dese proteínas.
Para algunhas aplicacións, un extracto bruto é suficiente. Non obstante, para outros usos, como en alimentos e productos farmacéuticos, é necesario un alto nivel de pureza. Para iso, adoitan usarse varios métodos de purificación de proteínas, nunha serie de pasos de purificación.
Cada paso de purificación de proteínas xeralmente resulta nun certo grao de perda de produto. Polo tanto, unha estratexia ideal para a purificación de proteínas é aquela na que se alcanza o máis alto nivel de purificación nos poucos pasos. A selección dos pasos a empregar depende do tamaño, carga, solubilidade e outras propiedades da proteína diana. As seguintes técnicas son máis axeitadas para a purificación dunha única proteína citosólica. A purificación dos complexos de proteína citosólica é máis complicada e normalmente require que se apliquen diferentes métodos.
Primeiros pasos para a purificación de proteínas
O primeiro paso para purificar as proteínas intracelulares (dentro da célula) é a preparación dun extracto cru .
O extracto contén unha mestura complexa de todas as proteínas do citoplasma celular, e algunhas macromoléculas, cofactores e nutrientes adicionais. O extracto bruto pode usarse para algunhas aplicacións en biotecnoloxía, con todo, se a pureza é un problema, deben seguirse as etapas posteriores de purificación.
Os extractos de proteína bruta prepáranse mediante a eliminación de escombros celulares xerados pola lise celular, que se consegue empregando produtos químicos e encimas , sonicacións ou unha prensa francesa. Os escombros son eliminados por centrifugación e recupera o sobrenadante. Os preparados en bruto de proteínas extracelulares poden obterse simplemente eliminando as células por centrifugación.
Para certas aplicacións biotecnolóxicas , hai unha demanda de enzimas termoestables : enzimas que poden tolerar altas temperaturas sen desnaturalizar e mantendo unha alta actividade específica. Os organismos que os producen ás veces son denominados extremófilos. Un enfoque fácil para a purificación dunha proteína resistente ao calor é desnaturalizar as outras proteínas da mestura ao calentarse e despois arrefriar a solución (permitindo así que a enzima termoestable reforma ou rediseña, se é necesario. As proteínas desnaturalizadas poden entón ser eliminadas por centrifugación.
Pasos de Purificación Intermedia
No pasado, un segundo paso común para a purificación dunha proteína a partir dun extracto bruto foi pola precipitación nunha solución con alta resistencia osmótica (é dicir, solucións salinas). Os ácidos nucleicos do extracto bruto poden eliminarse precipitando agregados formados con sulfato de estreptomicina ou sulfato de protamina.
As precipitacións proteicas adoitan ser empregadas con sulfato amónico como o sal.
As diferentes proteínas precipitaránse en diferentes concentracións de sulfato amónico . En xeral, as proteínas de maior peso molecular precipitan en concentracións máis baixas de sulfato de amonio. A precipitación de sal non adoita levar a unha proteína altamente purificada pero pode axudar a eliminar algunhas proteínas non desexadas nunha mestura e concentrar a mostra. As sales na solución son entón eliminadas por diálisis a través de tubulacións de celulosa porosa, filtración ou cromatografía de exclusión de xeles.
Os protocolos modernos de biotecnoloxía adoitan aproveitar os moitos kits comercialmente dispoñibles que proporcionan solucións preparadas para procedementos estándar. A purificación de proteínas faise a miúdo usando filtros e colunas de filtrado en gel preparadas. Todo o que tes que facer é seguir as instrucións e engadir o volume correcto da solución correcta e agardar o tempo especificado ao recoller o eluente (o que sae do outro extremo da columna) nun tubo de proba novo.
- Os métodos cromatográficos pódense aplicar usando columnas de banca superior ou equipos automatizados de HPLC. A separación por HPLC pódese realizar mediante métodos de reversa, intercambio iónico ou exclusión de tamaño e mostras detectadas por matriz de diodos ou tecnoloxía láser. El
Visualización e avaliación de proteínas da purificación
- A cromatografía de fase inversa (RPC) separa as proteínas en función das súas hidrofobicidades relativas. Esta técnica é altamente selectiva pero require o uso de disolventes orgánicos. Algunhas proteínas son permanentemente desnaturalizadas por disolventes e perderán funcionalidades durante o RPC. Polo tanto, este método non se recomenda para todas as aplicacións, especialmente se é necesario que a proteína obxecto de aprendizaxe conserve a actividade.
- A cromatografía de intercambio iónico refírese á separación de proteínas baseadas na carga . As columnas poden estar preparadas para o cambio de anións ou o intercambio catiónico. As columnas de intercambio aniónico conteñen unha fase estacionaria cunha carga positiva que atrae proteínas cargadas negativamente. As columnas de intercambio de cátions son as contas reversas negativas que atraen as proteínas cargadas positivamente. A elución da (s) proteína (s) obxectada realízase cambiando o pH na columna, o que resulta nun cambio ou neutralización dos grupos funcionais cargados de cada proteína.
- A cromatografía de exclusión de tamaño ( filtración en xel ) separa as proteínas máis grandes das pequenas xa que as moléculas máis grandes viaxan máis rápido a través do polímero reticulado na columna de cromatografía. As grandes proteínas non se encaixan nos poros do polímero mentres que as proteínas máis pequenas fan máis tempo e percorren a columna de cromatografía, a través da súa ruta menos directa. O eluato recóllese nunha serie de tubos que separan as proteínas en función do tempo de elución. A filtración de xel é unha ferramenta útil para concentrar unha mostra de proteína xa que a proteína diana recóllese nun volume de elución máis pequeno do que se engadiu inicialmente á columna. As técnicas de filtración similares poden usarse durante a produción de proteínas a gran escala debido á súa relación custo-eficacia.
- A cromatografía de afinidade é unha técnica moi útil para "pulir" ou completar o proceso de purificación de proteínas. As contas da columna de cromatografía están reticuladas a ligandos que se unen específicamente á proteína diana. A continuación, a proteína quítase da columna lavándose cunha solución que contén ligandos libres. Este método dá os resultados máis puros ea maior actividade específica en comparación con outras técnicas.
- A SDS-PAGE é a electroforesis en xel de poliacrilamida, realizada en presenza de SDS (sodio dodecil sulfato) que se une ás proteínas que lles dan unha gran carga negativa neta. Dado que as cargas de todas as proteínas son bastante iguais, este método sepáralas case completamente en función do tamaño. A SDS-PAGE úsase a miúdo para probar a pureza da proteína logo de cada paso dunha serie. Como as proteínas non desexadas son eliminadas gradualmente da mestura, a cantidade de bandas visualizadas no xel de SDS-PAGE redúcese ata que só hai unha banda que representa a proteína desexada.
- O inmunoblotting é unha técnica de visualización de proteínas aplicada en combinación coa cromatografía de afinidade. Os anticorpos para unha proteína específica utilízanse como ligandos nunha columna de cromatografía de afinidade. A proteína obxecto de aprendizaxe retívase na columna, despois elimínase lavando a columna cunha solución de sal ou outros axentes. Os anticorpos vinculados a etiquetas de colorante ou radioactivo axudan na detección da proteína meta xa que está separada do resto da mestura.
Fontes:
Zubay G. 1988. Bioquímica, 2 ª edición. Macmillan Publishing Co., Nova York, NY, EUA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Manual de Purificación de Proteínas, Edición AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Nova Jersey, EUA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.