A clonación xenética é o acto de facer copias ou clones dun só xene. Unha vez que se identifica un xene, os clones poden usarse en moitas áreas da investigación biomédica e industrial. A enxeñería xenética é o proceso de clonación de xenes en novos organismos ou a alteración da secuencia de ADN para cambiar o produto proteico. A ingeniería xenética depende da nosa capacidade de realizar os seguintes procedementos esenciais.
Reacción na cadea da polimerase 01
02 Encimas de restrición
O descubrimento de enzimas coñecidas como endonucleases de restrición foi esencial para a enxeñería proteica . Estas encimas cortaron o ADN en lugares específicos baseados na secuencia de nucleótidos. Centos de encimas de restrición diferentes, capaces de cortar o ADN nun sitio distinto, foron illados de diferentes cepas de bacterias. O ADN cortado cunha enzima de restrición produce moitos fragmentos menores, de tamaños diferentes. Estes poden ser separados usando electroforesis en xeles ou cromatografía.
03 Electroforese
O ADN purificador dun cultivo celular, ou o seu corte mediante enzimas de restrición, non tería moito uso se non puidemos visualizar o ADN, é dicir, atopar unha forma de ver se o seu extracto contén nada ou o tamaño que o fragmenta o cortei. Unha forma de facelo é mediante electroforesis en xel. Os xeles úsanse para diversos fins, desde a visualización do ADN cortado ata a detección de insercións de ADN e nocions.
04 Únete a dúas pezas de ADN
Na investigación xenética, moitas veces é necesario vincular dúas ou máis fíos individuais de ADN, crear unha liña recombinante ou pechar unha liña circular que foi cortada con enzimas de restrición. Os enzimas chamados ADN ligases poden crear enlaces covalentes entre as cadeas de nucleótidos. Os encimas ADN polimerase I e polinucleótido quinasa tamén son importantes neste proceso, para encher espazos ou fosforilación das extremidades 5 ', respectivamente.
05 Selección de ADN autoperplicante pequeno
Pequenas pezas circulares de ADN que non forman parte dun xenoma bacteriano, pero son capaces de auto-replicación, son coñecidas como plasmídeos. Os plasmídeos úsanse frecuentemente como vectores para transportar xenes entre microorganismos. Na biotecnoloxía, unha vez que se amplifica o xene de interese e tanto o xene como o plásmido son cortados por enzimas de restrición, ligan xuntos xerando o que se coñece como ADN recombinante. O ADN viral (bacteriófago) tamén se pode usar como vector, como poden cosmidos, plasmídeos recombinantes que conteñen xenes de bacteriófagos.
06 Método para mover un vector a unha cela do servidor
O proceso de transferencia de material xenético sobre un vector como un plásmido, en novas células hospedadoras, chámase transformación. Esta técnica require que as células do hospedeiro estean expostas a un cambio ambiental que lles fai "competentes" ou temporalmente permeables ao vector. A electroporación é unha técnica. Canto maior sexa o plásmido, menor será a eficiencia coa que é recollida polas celas. Os segmentos de ADN máis grandes son máis fácilmente clonados usando bacteriófagos, retrovirus ou outros vectores ou cosmídeos virales nun método chamado transdución. Os vectores fagos ou vectores son frecuentemente utilizados na medicina rexenerativa pero poden causar a inserción do ADN en partes dos nosos cromosomas onde non o queremos, causando complicacións e mesmo o cancro.
07 Métodos para seleccionar organismos transxénicos
Non todas as células tomarán ADN durante a transformación. É esencial que haxa un método de detección dos que fan. Xeralmente, os plásmidos levan xenes para a resistencia aos antibióticos e as células transxénicas poden ser seleccionadas en función da expresión deses xenes ea súa capacidade de crecer nos medios que conteñen ese antibiótico. Os métodos alternativos de selección dependen da presenza doutras proteínas reporteras, como o sistema x-gal / lacZ , ou a proteína fluorescente verde, que permiten a selección en función da cor e a fluorescencia, respectivamente.